KRAS突变可驱动肿瘤发生，在胰腺癌、肺癌和结直肠癌中尤为常见。KRAS是极具价值的肿瘤治疗靶标，但该蛋白的结合界面平坦，缺乏深层疏水口袋，难以成药。而大环化合物与环肽能够作用于以往难以成药的靶点。
近期，来自Schrödinger公司的科学家使用5类不同的大环及环肽抑制剂系列（KRAS、PCSK9、MCL-1、JAK2以及Cyclin A/B），对FEP+计算框架进行了回顾性验证（点击阅读），突出了FEP+对于降低研发风险、推进药物发现的优势。本文将聚焦KRAS部分的解读。
1. KRAS大环分子数据集与建模策略
为评估FEP+的预测性能，研究者采用45个结构同源的11元大环肽分子（Tanada等人报道）构建了分子库。这些大环分子靶向KRAS蛋白，可抑制关键的KRAS-SOS1蛋白-蛋白相互作用，进而减弱下游致癌信号通路。
该系列分子的实验活性采用KRAS-SOS Alpha-Screen抑制实验测定。数据集包含已优化的临床候选分子LUNA18（化合物45），该分子对包括G12C、G12D在内的多种KRAS变异体均表现出亚纳摩尔级强效抑制活性（KRAS-SOS IC₅₀：0.42-0.58 nM）。
FEP+模拟基于高分辨率共晶结构开展（PDB编号：7YUZ、8JJS）。两个晶体结构的Switch II区域主链RMSD为3.5 Å，存在显著的诱导契合构象转变，因此采用双态（dual-state）建模策略：系列1（化合物1-17）采用未发生诱导变形的SII构象，系列2（化合物18-45）采用扩张后的SII构象。7YUZ（KRAS-化合物1共晶，分辨率1.88 Å）用作化合物1-17的模板结构，8JJS（KRAS-化合物18共晶，分辨率1.53 Å）用作化合物18-45的模板结构。
图注：(A) 结构叠合图，突出Switch II（SII）亚口袋的构象可塑性；(B) 诱导契合型SII-hole的分子基础
2. 定量性能与排序精度
尽管结合表面偏浅、暴露于溶剂环境，且实验测得的动态区间相对较窄（ΔGrange=5.1 kcal/mol，相当于IC₅₀数值跨度接近4个数量级），FEP+在这个45个化合物的数据集上仍展现出优异的预测精度（如下图）。
图注：FEP+针对KRAS（G12D）大环分子数据集的预测性能
该模型的成对ΔΔG均方根误差（RMSEΔΔG）为1.32 kcal/mol，平均无符号误差（MUEΔΔG）为1.01 kcal/mol，两项指标均处于支持前瞻性先导化合物优化所需的精度范围内。受限于较窄的动态区间，决定系数R²仅为0.48，但斯皮尔曼相关系数ρ=0.79、肯德尔相关系数τ=0.61，证明模型具备可靠的亲和力排序能力。
这样级别的敏感度尤为重要，因为该系列化合物的优化工作很大一部分聚焦于通过主链刚性化提升膜通透性。即，将大环分子锁定为可穿透细胞膜的构象，同时不损失SII-hole带来的结合活性。面对这类大幅度主链修饰与N-甲基化改造，FEP+仍可保持较高预测准确度，说明其适用于亚纳摩尔活性区间内的合成优先级筛选。
3. 双态建模策略的验证
该双态策略取得了良好效果，揭示了自由能模拟的一项核心原则：在对bRo5类先导物的诱导契合构象转变开展计算模拟时，准确的起始结构至关重要。尽管REST增强采样技术对于探究大环主链复杂的构象集合不可或缺，但获取结构适配的受体模板，仍是捕捉大幅度蛋白构象重排的首要前提。
交叉对照试验验证了该双态策略的必要性：
系列1
两套模板（7YUZ或8JJS）均能较好复现该系列类似物的实验活性；相较于诱导契合构象的8JJS结构，未扩张的7YUZ结构预测精度更优（下图A、B）。该结果与结构观测结论一致，即系列1配体无需SII亚口袋发生扩张。
系列2
采用未发生诱导变形的7YUZ模板对C7位大位阻取代化合物建模时，预测准确度显著下降（下图C）。该偏差源于配体侧链与SII区域“闭合”主链之间产生严重空间冲突，仅依靠增强采样无法消除该冲突。因此，必须采用能够体现诱导契合效应的8JJS结构，才可提升FEP+的预测精度（下图D）。
图注：针对KRAS大环分子数据集的FEP+双态建模策略交叉对照评估
简言之，当初始蛋白-配体结合构象能够反映具备生物学意义的诱导契合状态，FEP+就可以对高亲和力大环先导物完成可靠的优先级排序。
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参考资料
1. Awoonor-Williams, Ernest, et al. "Derisking Affinity Optimization for Macrocycles and Cyclic Peptides: High-Precision Free Energy Simulations across Five Diverse Targets." Journal of Chemical Information and Modeling (2026).
2. Tanada, Mikimasa, et al. "Development of orally bioavailable peptides targeting an intracellular protein: from a hit to a clinical KRAS inhibitor." Journal of the American Chemical Society 145.30 (2023): 16610-16620.
