在上篇中，我们介绍了FEP指导的苗头化合物发现、母核筛选、母核结构修饰。接下来是理化性质的优化及结合模式的分析。
一、理化性质与ADME
为指导化合物理化性质优化，研究人员计算了E-sol值及LogD。这些参数有助于平衡分子极性与脂溶性，提升被动膜通透性（低外排率），在保留药效与成药性的同时，满足透脑所需的条件。
下表汇总了合成的代表性化合物的初步体外ADME成药性评价结果，证实该系列化合物具备良好的成药潜质。该系列化合物整体水溶性中等、LogD偏高，需在后续分子设计中优化偏强的脂溶性，以均衡ADME各项性质。
图注：代表性化合物的体外ADME性质
二、晶体结构与III型结合模式
为明确结合模式，研究人员解析了野生型c-MET与化合物17的共晶结构。结果显示，该小分子作用于激酶结构域内、ATP结合区旁侧且介于N端与C端叶之间的疏水口袋，并不占据ATP结合位点，符合III型激酶抑制剂的结合特征。相较于化合物1的共晶结构，化合物17结合至该变构位点后，可促使活化环（A环）发生显著的构象改变（如下图）。
图注：D1228V突变体与化合物1（绿色）的晶体结构叠合到野生型蛋白与化合物17（粉色）的晶体结构
分子母核的内酰胺基团可与亮氨酸（LEU）1140、天冬氨酸（ASP）1222形成两处氢键，该作用位点不属于经典铰链区，可形成全新的锚定作用，使配体远离传统的ATP结合区域（如下图）。
图注：结合了化合物17的野生型c-MET蛋白晶体结构
该氢键作用模式，尤其是与亮氨酸1140的相互作用属于全新结合模式。在获得X射线晶体结构前，FEP已精准预测出该作用模式（如下图）。吡啶氮原子与赖氨酸（LYS）1110间距约3 Å，可形成稳定的极性静电作用，稳固配体结合构象。苄基取代基嵌入疏水亚口袋，与苯丙氨酸（PHE）1200、苯丙氨酸1134形成π-π堆积作用，大幅提升结合亲和力。
图注：FEP预测的化合物4在D1228V突变体中的典型结合构象，其预测结合模式与化合物17实测结合模式高度相近、
同时，吡唑取代苯环可伸入A环重排后形成的空腔内，该构象变化会使天冬氨酸1228偏离结合口袋，无法与配体产生直接相互作用。晶体结构同时证实苄基位点为R构型，与FEP预测结果完全一致。
三、回顾性FEP验证
化合物1的回顾性FEP分析均方根误差（RMSE）为1.37 kcal/mol（下图a），已达到药物化学研发决策领域公认可接受精度的上限。采用全新解析的共晶结构进行回顾性FEP计算，理论结合亲和力与实验测定结果高度契合（下图b），成对分析结果为RMSE = 1.05 kcal/mol、MUE = 0.87 kcal/mol。
图注：回顾性FEP相关性散点图（a采用化合物1的晶体结构，b采用化合物17的晶体结构）
尤为重要的是，借助该晶体结构开展FEP运算，可精准还原明显的构效关系陡变效应。这也凸显出，在同系列化合物研究中获取高质量结构数据，是充分发挥FEP预测能力的关键。
总的来说，III型结合模式可作为治疗c-MET驱动型肿瘤切实可行且具备差异化优势的治疗策略。同时，这项研究也凸显了FEP指导全新骨架挖掘在药物早期研发中的应用价值。
图注：从已知化合物1优化得到全新的化合物20
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参考资料
Therrien, Eric, et al. "Discovery of 2H-Pyrrolo [3, 4-c] pyridin-3-one Derivatives as Type-III c-MET Inhibitors Enabled by Free-Energy Perturbation Calculations." ACS Medicinal Chemistry Letters (2026).
