想解锁单细胞RNA Velocity分析，揭秘细胞动态变化规律？这份带数据包的实操指南，带您从零开始复现COVID-19仓鼠模型中的药物作用研究，掌握从数据导入到结果解读的全流程，新手也能轻松上手！
本教程基于的研究数据聚焦地塞米松与某抗体单独及联合治疗COVID-19感染仓鼠的效果，重点复现原文图5的核心发现并进行拓展分析。研究通过单细胞转录组技术，探究了中性粒细胞在药物干预下的动态变化，为理解COVID-19治疗机制提供了关键视角。
图注：研究摘要图
图注：原文献中的单细胞RNA Velocity分析
开展分析前需准备：CLC Genomics Workbench 22.0.2及以上版本、CLC Single Cell Analysis Module 22.1.1及以上版本。
2.数据导入
首先联系我们获取教程数据包，包含表达矩阵（spliced/unspliced）、细胞注释、细胞聚类文件及专用工作流。通过Reference Data Manager下载参考基因组。通过Import Expression Matrix in MEX format工具（如下图）导入矩阵，注意勾选Import spliced/unspliced以支持后续Velocity分析。
同理，通过Import Cell Clusters和Import Cell Annotations导入对应的文件。
3.QC与标准化
通过QC for Single Cell工具，选择导入的表达矩阵，默认参数运行后生成过滤矩阵和QC报告，该步骤会去除双胞（doublet）和低质量细胞。接着使用Normalize Single Cell Data工具对过滤后的矩阵进行标准化，输出残差矩阵（residual matrix）和报告。
原文献作者用于细胞类型注释的许多标志物基因均出现在报告的高变异基因（highly variable genes，HVGs）列表中。这说明CLC报告的HVGs可用于细胞类型注释。
4.UMAP可视化与中性粒细胞定位
利用UMAP for Single Cell工具对残差矩阵进行降维分析，设置了2000个HVGs（如下图）。
打开生成的UMAP图后，通过Expression data面板添加Camp和S100a8标志物，设置最低表达量为50（如下图）。
选择Selected in all (intersect)高亮同时表达两种标志物的细胞（如下图）。
结合作者提供的细胞聚类注释（如下图），通过套索工具选中中性粒细胞集群并创建子集，也可使用Predict Cell Types工具验证细胞类型，其结果与作者注释高度一致。
预测的细胞类型与作者标注的细胞类型之间的关系，可通过Create Heat Map for Cell Abundance工具进一步探究。不过在进行此分析前，需使用Combine Cell Clusters工具合并这两组细胞群。
5.RNA Velocity分析
导入Analyze RNA Velocity in Neutrophils Workflow.clc工作流，该流程整合了标准化、UMAP可视化、Velocity矩阵生成等步骤（如下图）。选择中性粒细胞子集的残差矩阵、细胞聚类和注释文件作为输入。
运行后即可生成Velocity矩阵、相图（Phase Portrait）、Velocity基因评分等多个输出文件（如下图）。
通过UMAP图中的箭头可直观呈现细胞转录组动态趋势，结合Leiden聚类（分辨率1.5）可复现原文中的中性粒细胞亚群（如下图）。
6.核心结果解读与拓展
右键点击UMAP图后通过Create Expression Plot工具生成Ccl3、Csf1、Cxcl10等关键基因的点图（如下图），发现细胞群6的基因表达模式与原文高度吻合，且周围细胞的Velocity箭头均指向该群。
结合病毒载量注释（右侧栏选择log10 SCoV2_sum）（如下图），可见高病毒载量细胞集中在细胞群6附近，且Velocity箭头指向该区域，与原文结果一致。
对比联合治疗（dexab）与未治疗（Untr）样本（如下图），发现在细胞群6中，接受联合治疗的细胞数量少于未接受治疗的细胞。
7.Velocity基因深度挖掘
打开由工作流生成的velocity genes scores文件，显示表达并非处于稳态而是被上调或下调的基因，其中Csf1在未治疗组和细胞群6、7、8、10中表现出高Velocity基因的可能性，其表达主要集中在高病毒载量区域（如下图）。
通过相图可观察到Csf1的上调趋势，而top velocity基因Hmgb2（免疫相关基因）则呈现下调特征（如下图）。这些结果为解析药物对免疫细胞功能的调控机制提供了关键线索。
总结
本教程覆盖了单细胞RNA表达与Velocity分析的核心流程，通过复现COVID-19药物研究的关键发现，帮助研究者快速掌握CLC相关工具的使用技巧。RNA Velocity分析不仅能验证已知生物学结论，还能挖掘潜在的关键基因和细胞动态变化规律，为疾病机制研究和药物研发提供有力支持。
更多拓展分析如差异表达基因鉴定、潜伏时间分析等，等待您进一步探索！
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Perform Single Cell RNA Expression and Velocity Analysis, September 5, 2022, QIAGEN
Wyler, Emanuel et al. “Key benefits of dexamethasone and antibody treatment in COVID-19 hamster models revealed by single-cell transcriptomics.” Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy vol. 30,5 (2022): 1952-1965. doi:10.1016/j.ymthe.2022.03.014
