烟曲霉（Aspergillus fumigatus）等丝状真菌人类病原体（FFHP）对现有抗真菌药物的耐药性正不断增强。核苷二磷酸激酶（Ndk）作为潜在的作用靶点，对核苷酸生物合成具有重要意义，它同时也是真菌代谢过程中的关键物质。
研究人员通过计算生物学方法，针对Ndk蛋白探究了紫杆菌素（Violacein）（一种天然食用色素）对烟曲霉的抗真菌作用。具体而言，研究人员首先分析了Ndk蛋白与其他蛋白的已知及预测的相互作用。然后使用薛定谔软件（Schrödinger Maestro），在OPLS4力场及增强精度对接模式下进行分子对接；在OPLS4力场与TIP3P溶剂体系下进行分子动力学模拟（MDS）；采用Becke三参数交换泛函（B3LYP）方法完成密度泛函理论（DFT）相关的几何优化。具体步骤及结果包括：
1、蛋白质准备（Prime、Epik、Glide）
将Ndk蛋白的晶体结构导入Maestro界面，借助Prime模块补全蛋白缺失的链与环结构，移除调控组件。采用Epik模块在pH 7.5条件下分配质子化状态并添加氢原子，结合PROPKA工具优化蛋白质子化状态。以OPLS4力场对蛋白进行能量最小化，删除距离活性口袋5Å以上的水分子并分配部分原子电荷。最后基于蛋白中已存在的参照配体（GDP），在Glide受体网格生成面板构建活性口袋，为后续对接奠定基础。Schrödinger软件的Prime、Epik等模块能精准补全蛋白结构缺陷并优化理化状态，其集成的力场与丰富的工具包大幅提升了蛋白质预处理的效率与准确性。
2、配体准备（Epik）
获取紫杆菌素结构进行能量优化并生成精确的三维结构。配体准备步骤十分关键，需生成适用于分子对接的最优结构，并排除配体相关误差。使用Epik模块在OPLS4力场条件下进行能量最小化，过程中需维持电离状态下pH为7，同时设定脱盐、单互变异构体（tautomer）生成，并保持特定的手性。
3、分子对接（Glide XP）
采用Glide XP对接模式，将优化后的紫杆菌素与GDP分别对接至Ndk蛋白活性口袋。结果显示：紫杆菌素与Ndk形成4个氢键（下图紫红色箭头）、2个盐桥及2个Pi-Pi堆叠作用，Glide g评分为-7.211 kcal/mol；GDP与Ndk形成4个氢键及2个Pi-Pi堆叠作用，Glide g评分为-7.010 kcal/mol。选择最优的复合物构象后，对其进行分子力学-广义玻恩表面积（MM-GBSA）计算。
图注：紫杆菌素和参照配体与Ndk蛋白的2D相互作用图
通过GDP对接前后构象叠加验证了对接方案的可靠性，叠加后均方根偏差（RMSD）为1.54 Å，表明对接结果可信，且紫杆菌素与Ndk的结合亲和力更强。Schrödinger的Glide XP模块具备增强精度算法，能高效预测配体-蛋白结合模式，其生成的g评分可量化结合亲和力，为配体活性筛选提供直观依据。
图注：分子对接前（蓝色）后（红色）参照配体的叠加图
4、分子动力学模拟（Desmond）
在Desmond平台对紫杆菌素-Ndk、GDP-Ndk复合物进行分子动力学模拟：在TIP3P水溶剂模型中构建10×10×10 Å正交晶盒（orthorhombic box），通过System Builder构建OPLS4力场，添加0.15 M NaCl中和体系。此外，使用能量最小化工具完成了体系的能量最小化处理。
图注：蛋白-配体RMSD与蛋白RMSF
分析结果显示：蛋白质RMSD在1-3Å的变化表明该蛋白质在结合和模拟过程中没有发生任何显著的构象变化（如上图）。结合蛋白二级结构分析，分子对接和随后的分子动力学模拟发现紫杆菌素复合物与GDP复合物相比更稳定，仅C端有轻微的构象波动。
图注：蛋白-配体RMSD与蛋白RMSF
分析结果显示：蛋白质RMSD在1-3Å的变化表明该蛋白质在结合和模拟过程中没有发生任何显著的构象变化（如上图）。结合蛋白二级结构分析，分子对接和随后的分子动力学模拟发现紫杆菌素复合物与GDP复合物相比更稳定，仅C端有轻微的构象波动。
图注：模拟轨迹中配体的性质
5、动力学后分析（MM-GBSA）
将分子动力学模拟后生成的轨迹用于热MM-GBSA分析。利用500ns的分子动力学轨迹，对紫杆菌素、GDP分别与6XPS形成的结合复合物的结合自由能进行估算，共获得101个快照（snapshot）。
图注：MM-GBSA分析公式
从分子动力学模拟过程中不同时间点获取的快照可看出，紫杆菌素与6XPS的结合稳定性优于GDP与6XPS的结合稳定性（如下图）。这种结合能分解对于阐明每个残基对配体结合的重要性至关重要，Schrödinger可无缝衔接动力学模拟与后分析流程，其内置的MM-GBSA工具能快速完成结合自由能计算与残基分解，提升了数据处理的效率和便利性。
图注：整个500ns分子动力学模拟中的MM-GBSA结合自由能值（轨迹的101个快照）
6、DFT计算（Jaguar）
为分析化合物与受体蛋白之间的相互作用，通过Jaguar模块采用B3LYP泛函与6-31G(d,p)基组对紫杆菌素与GDP进行DFT计算。结果显示：紫杆菌素的最高占据分子轨道（HOMO）能量、最低未占据分子轨道（LUMO）能量、能带隙（ΔE）、静电势均小于GDP，表明紫杆菌素极性更强、动力学稳定性更低、化学反应活性更高。
图注：紫杆菌素和GDP参考配体的整体反应性描述
这些数据进一步支持了紫杆菌素作为Ndk抑制剂的潜力。Schrödinger的Jaguar作为一种快速准确预测分子结构和性质的量子力学方法，在DFT计算中优势突出，其丰富的泛函与基组选择及高效的计算引擎，能精准获取分子电子结构与化学性质参数。
图注：HOMO、LUMO和分子静电势表面的3D图
总的来说，计算生物学的研究结果表明紫杆菌素有望通过靶向作用于Ndk蛋白来干扰真菌的核苷酸代谢，进而发挥抗真菌活性。
参考文献：
Sindhu, R., et al. "Gaining molecular insights towards inhibition of foodborne fungi Aspergillus fumigatus by a food colourant violacein via computational approach." Scientific Reports 14.1 (2024): 1-17.
