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October 28, 2022

IPA案例十五——QIAGEN为循环转录组学提供进阶RNA-Seq挖掘整体解决方案



简介:胰腺癌是预后差、最致命的恶性肿瘤之一。因此,了解肿瘤发生、发展和转移的机制是一直是癌症研究的重点。近来,液体活检是一种全新的检测手段,采用的是非侵入性的诊断方法来检测癌症的早期,为获得更成功的治疗提供基础。其中一种液体活组织检查技术是从肿瘤微环境来源的外泌体中检测标志RNA,这些外泌体有可能参与了产生转移的病灶。使用QIAGEN生物信息学解决方案与公开的数据集,深度挖掘了Kupffer细胞的摄取胰腺肿瘤来源的外泌体后转录组数据。以研究受到胰腺癌外泌体影响的Kupffer细胞诱导肝转移灶的形成过程中涉及的途径和生物学过程。


实验方法:
      1、如图一所示,本文采用Kupffer细胞(KC细胞)加入从胰腺癌细胞系转移到肝脏的外泌体(BxPC-3),设计对照,进行RNA-Seq数据采集。


IPA

 

图一:测序样本准备流程图。


      2、原文采用的是公共平台和R进行处理,本文采用同样的数据,用QIAGEN的Bx+IPA进行数据的深度挖掘。
      3、Bx进行RNA-Seq原始数据FASTQ处理。进行序列处理比对,最终得到基因或者转录本的表达值。并且获得差异表达谱数据
      4、IPA处理差异表达谱数据进行深度数据挖掘。


分析结果:
     
1、Bx进行RNA-Seq原始数据FASTQ处理结果。可以在Bx中直接搜索SRP058375,进行数据的下载和直接整理导入。


IPA

 

图二:可以采用Bx-Download-Search for reads in SRA工具,直接搜索SRA样本号。并且全选所有数据,点击红框内按钮,进行数据的直接下载和整理。

  2、采用Toolbox-RNA-Seq Analysis工具,可以直接获得基因表达值(GE:Gene Expression)及转录本表达值(TE:Transcription Expression)


IPA 


图三:存于Bx中处理好的样本表达值

  所有表达值结果存在Bx的数据文件夹中,可以进行下游的差异表达分析。


IPA 


图四:Bx可以针对每组数据的表达值进行基本的统计特征分析。能够进行Venn Diagram,PCA plot, Heatmap,Volcano Plot的分析和绘制。

  按照Metadata分别计算单纯BxPC-3组(仅添加外泌体组)和BxPC-3+ITGB5 inhibitor组与对照PBS组的差异值,并使用IPA插件,将结果直接上传到IPA中进行查看。


IPA 


图五:BxPC-3组对比PBS组计算的差异表达基因示例结果。这个结果可以直接在Bx中使用插件上传到IPA中。

  Bx计算得出BxPC-3 exosomes VS PBS treated control,  BxPC-3 exosomes VS BxPC-3+ITGB5 inhibitor与BxPC-3+ITGB5 inhibitor VS PBS treated control三组的差异值,并且直接上传到IPA中进行核心分析。

  3、IPA数据分析结果

  针对Bx给出的差异表达的数据集分别作了核心分析。统一采用Fold change FC为1.5,p值小于0.05,RPKM>5作为阈值,对三组数据进行了核心分析,并且将三组核心分析结果进行对比分析。
      通过IPA的分析,我们能够进行以下问题的探索:
      哪些信号通路参与转移前微环境的改变?
      靶细胞中哪些转录调控路径是激活还是抑制的?
      Kupffer细胞摄取PDAC外泌体后发生了哪些生物学过程?
      有哪些基因发生了剪辑突变?
      从这个研究中我们能得到抑制PDAC转移的什么启示?

  IPA通过针对数据的核心分析和对比分析,逐一解决上述问题。


IPA 


图六:核心分析总览。总览包括对经典通路,上游调节分子,疾病和生物学功能等内容的概括,能够第一时间了解差异表达基因的聚类及分析结果。


IPA

图七:经典通路聚类结果。橙色代表被预测激活的通路,蓝色代表被预测抑制通路。由图上可以看出,在Kupffer细胞摄入BxPC-3外泌体后,基因表达和免疫反应相关的通路被激活了。排名第一的是IL-6信号通路,由此可见,IL-6信号通路会参与前转移微环境的改变。


IPA

 

图八:IL-6信号通路的简介,能够在IPA中直接查看信号通路的介绍,参与基因,作用药物,参与疾病和功能等信息。


IPA 


图九:IL-6信号通路示意图。BxPC-3 vs BxPC-3 Beta5KD的差异基因显示IL6信号通路同样被预测为激活状态。对该信号通路进行深度探索,寻找这个信号通路参与的生物学过程,发现,这个信号通路主要参与白细胞分化过程。

  由通路聚类的结果可以看到在摄入BxPC-3外泌体后,IL-6通路成激活状态,并且免疫反应相关的信号通路多为激活状态,结合以上结论查看上游调控因子的分析结果来看。如果仅看细胞因子和生长因子为上游调控因子的结果,发现免疫反应相关的上游调控因子都发挥了激活下游分子的作用。


IPA 


图十:与免疫反应相关的细胞因子和生长因子均表现出激活的作用。


IPA 


图十一:根据图十的结果,将IL-6及其下游因子共同进行网络挖掘,发现这个网络的分子参与了肿瘤细胞系的黏附和侵袭活动,并且参与了肝癌的发生。


IPA 

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图十二:进行上游调控因子的对比分析发现,TRIM24及其下游分子在摄入BxPC-3后被激活,能够抑制细胞的免疫反应,而当其被抑制时则能激活细胞的免疫反应。而MEOX2摄入了BxPC-3被抑制,能够激活Angiogenesis,metastasis和recruitment of myeloid cells几个疾病和生物学过程。


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图十三:进行三组数据份疾病和生物学功能对比分析发现,在摄入BxPC-3后,与肿瘤转移与侵袭的功能被激活了。


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图十四:采用IPA的Isoprofiler分析可以直接对比多条Isoform在不同的数据样本中的表达值发现,有一条ITGB1-007转录本可能会在肝转移的过程中起重要作用。


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图十五:利用IsoProfiler分析得到与肝癌相关并且对BxPc-3摄入有反应的基因PKM。及其Isoform PKM-004可能会起到关键作用。


IPA 

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图十六:IPA的Causal Network分析能够给出主调节因子,为分析给出可能的作用靶点。如图示例,IL6R是一个主调节因子,摄入BxPC-3外泌体后,IL6R被激活并且激活转移功能,如果使用toalizumab对IL6R进行抑制,能够有效的抑制转移。


总结
      以上结果仅是IPA分析结果部分示例,从IPA中能够得到的启示性结果还有很多,能够根据研究方向进行结果的解读。就本案例为例,本文分析了Kupffer细胞摄入胰腺癌外泌体后的RNA表达数据,能够得到下面的结果。
      哪些信号通路参与转移前微环境的改变?(IL6信号通路)通过Canonical Pathways和Pathway Activity Analysis功能实现。
      靶细胞中哪些转录调控路径是激活还是抑制的?(IL6,TRIM24,MEOX2)通过Upstream Analysis和Comparison Analysis功能实现。
      Kupffer细胞摄取PDAC外泌体后发生了哪些生物学过程?(纤维化,血管生成,免疫反应)通过Disease & Functions,Comparison Analysis和Downstream Effects Analysis功能实现。
      有哪些基因发生了剪辑突变?(ITGB1,PKM2)通过Isoform View和IsoProfiler功能实现。
      从这个研究中我们能得到抑制PDAC转移的什么启示?(IL6R,IL11RA)通过Causal Network Analysis功能实现。


参考资料:
源于QIAGEN官网Webinar:
Understanding  the  circulating  transcriptome  with  Advanced  RNA-Seq Explorer Solution
http://tv.qiagenbioinformatics.com/video/15765809/understanding-the-circulating-transcriptome-with