KRAS属于小GTP酶家族，作为多种信号级联上游的二元开关，调控细胞增殖与存活。KRAS突变可驱动肿瘤发生，在胰腺癌、肺癌和结直肠癌（CRC）中尤为常见。利用小分子抑制剂靶向突变型KRAS的药物研发在G12C和G12D突变中已取得成功。

然而，G12V、G13D、Q61L和A146T等具有临床意义的RAS突变仍是难以攻克的药物靶点，解析其结构特征对于开发新型有效治疗方案至关重要。

来自瑞典药企Oblique Therapeutics、瑞典卡罗林斯卡学院的研究人员及其合作者发表了一项研究，通过X射线晶体学技术，在无镁离子的磷酸盐和丙二酸盐缓冲液中，解析了KRAS G13D突变体的P环暴露构象，分辨率达1.4-2.4 Å（如下图）。该G13D构象中，开关I区域呈垂直位移状态，使催化核心完全暴露。为验证该构象的可成药性，研究人员开发了一种靶向P环的单克隆抗体（mAb）。

图注：X射线晶体学揭示开放态的KRAS突变体

研究人员使用PIPER工具（BioLuminate，薛定谔）进行了分子对接模拟，验证免疫球蛋白G（IgG）单克隆抗体对完全开放态KRAS P环的可及性。具体而言，以轻链和重链可变区的氨基酸序列作为输入，构建4B8的同源模型。轻链和重链分别选用不同模板。

若自动分配的互补决定区（CDR）序列坐标与实验鉴定结果存在偏差，则对其进行修正，并生成5种不同的CDR区模型。以人IgG1的结构为基础，分别构建可变片段（Fv区）和完整抗体（含两个对称的抗原结合片段Fab区与可结晶片段Fc区）的模型。由于CDR区序列相似度低于0.7，采用Prime模块的从头环预测功能对其结构进行优化。

随后，将基于Fv区建模的5种4B8模型分别与多种KRAS晶体结构进行对接。引入了一组中等强度的吸引约束（吸引势能的缩放因子提高50%），约束范围包含用于表位筛选的KRAS 10–21位。

含鸟苷5ʹ二磷酸（GDP）时，单克隆抗体与KRAS G13D的相互作用对接构象如下图所示，单克隆抗体的Fv区及其CDR与表位对齐，并发生相互作用。

图注：4B8与开关I处于完全开放构象的KRAS G13D的结合模式

图注：对接构象显示抗体4B8的Fv区与人KRAS G13D蛋白区域10–21的相互作用（箭头指示不同取向）

图注：对接构象显示抗体4B8与人KRAS G13D蛋白区域10–21相互作用的表面模型

以上结果说明，4B8可能通过结合与P环重叠的表位，阻止开关I区域闭合。这将通过阻断效应因子结合区的形成（即开关I与开关II聚合时拟形成的下游效应因子相互作用界面被阻断），将KRAS锁定在无活性过渡态。总之，分子对接与统计学检验证明，与野生型KRAS及其G12D突变体相比，单克隆抗体4B8与完全开放态G13D的结合作用更强。

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PIPER是一款经过CAPRI盲测验证的蛋白-蛋白分子对接工具。它采用快速傅里叶变换（FFT）算法和多阶段处理流程，能够高效采样数十亿种结合取向，精准预测蛋白质复合物结构。它在保持高计算效率的同时，显著提升了近天然结构的筛选成功率，并针对抗体-抗原等特定复合物类型进行了专业的优化。

Prime是一款用于蛋白结构预测（如同源建模）和优化（如诱导契合）的强大工具，致力于获得高质量的受体结构模型。它通过同源建模和蛋白折叠识别技术，可以根据氨基酸序列预测出蛋白质的三维结构。其次，“诱导契合”功能可以模拟蛋白活性位点在与不同配体结合时发生的构象变化，从而提供更真实的结合模式预测。此外，它还提供强大的Loop区建模和侧链优化能力。

抗体4B8对G13D具有高亲和力结合活性，高分辨率荧光显微镜检测显示，它可通过巨胞饮作用被G13D突变型HCT 116细胞（人结直肠癌细胞来源）自发摄取。磷酸化蛋白质组学（由IPA软件分析）和基因组学研究证实，该抗体可抑制KRAS信号通路。（点击了解如何利用IPA分析多组学数据。）

图注：4B8的磷酸蛋白质组学和基因表达谱显示KRAS信号下调

图注：4B8的作用机制和可能的疾病相关性

综上，这项研究通过结构解析、分子对接与生物学验证，揭示了KRAS G13D突变体在细胞内可及的新型可成药空间。这些发现有望推动通过单克隆抗体或其他方式，针对这种完全开放状态的G13D构象开发靶向药物。

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参考资料

Jungholm, Oscar, et al. "Novel druggable space in human KRAS G13D discovered using structural bioinformatics and a P-loop targeting monoclonal antibody." Scientific Reports 14.1 (2024): 19656.