外周T细胞淋巴瘤通常具有侵袭性且预后不良。由于缺乏能够区分健康细胞与恶性细胞的靶抗原，免疫治疗的疗效受到了限制。T细胞受体（TCR）会以互斥表达的方式呈现两种高度同源的链之一，即T细胞受体β链恒定区1（TRBC1）和恒定区2（TRBC2），这使其成为极具潜力的治疗靶点。

来自英国药企Autolus Therapeutics的研究人员及其合作者通过结构导向的计算生物学方法进行理性设计，实现了抗体特异性的重定向改造，成功设计出TRBC2特异性抗体KFN。

抗体KFN可与此团队先前研发的具有独特TRBC1特异性的抗体Jovi-1形成补充，从而能够靶向克隆性表达两种TRBC亚型中任意一种的更广谱T细胞恶性肿瘤。基于这两种抗体，研究人员进一步制备出分别靶向TRBC1和TRBC2的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞），且临床前研究证据已证实其在治疗T细胞恶性肿瘤方面具备显著疗效。

抗体药物的设计存在诸多挑战：平衡亲和力与特异性，特异性抗体构建及翻译后修饰调控，降低免疫原性，规避脱靶毒性带来的安全风险。那么，研究人员使用了哪些工具和方法应对这些难题呢？

1. Jovi-1的人源化

研究人员采用计算模拟同源建模与互补决定区（CDR）移植技术，对此前报道的鼠源Jovi-1抗体（MuJovi-1）进行了人源化改造。

具体而言，基于KABAT编号系统，对αTRBC1 Jovi-1的CDR区进行了界定，并借助BioLuminate软件（薛定谔Schrödinger），将这些区域分别嵌入选定的人源化重链框架（IGHV1-2*02）与人源化轻链框架（IGKV2-29*02）中。

随后，将人源化的重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）序列合成为G blocks™，并将其亚克隆至AbVec重链表达载体与AbVec κ轻链表达载体中。最后，将表达载体共转染至细胞中制备全长抗体。

所得的人源化抗体HuJovi-1与人源TRBC1的结合动力学特征同MuJovi-1相当（如下图）。正如预期，HuJovi-1抗体维持了对TRBC1的特异性，未检测到与TRBC2的结合信号。

图注：Jovi-1抗体的表面等离子体共振检测（SPR）

2. HuJovi-1–TCR复合物的晶体结构

蛋白质建模与计算模拟分析采用BioLuminate软件完成。所有复合物的结构预处理过程包括以下部分：通过软件中的Protein Preparation Wizard工具，补全缺失的氨基酸侧链（若有需要）、计算氢原子坐标、优化氢键网络、执行能量最小化。利用BioLuminate的残基扫描功能计算得出复合物结合亲和力的预测变化值，计算时设定抗体为配体，T细胞受体为受体。

图注：TCR靶向抗体和TRBC1/2之间的结构建模和相互作用

HuJovi-1与TRBC2形成复合物的解析结构，从分子层面进一步阐释了该抗体的特异性（如上图）。TRBC2中Asn119与Lys120的倒置，消除了其与HuJovi-1的Thr28氢键势。相较于结合TRBC1时的构象，HuJovi-1结合TRBC2时Thr28呈现旋转构象。因此，Lys120的侧链不再能与Thr28成键，而是以更弯曲的旋转异构体构象容纳于结合口袋中。

总之，分子界面上的这些差异共同赋予了Jovi-1对TRBC1的高度选择性。

3. 抗TRBC2单克隆抗体的结构工程化

为探究能否通过HuJovi-1获得对TRBC2特异性更强的抗体，研究人员基于两种复合物的晶体结构开展了计算模拟残基扫描突变（mutagenesis）进行分子改造。首先，针对抗体的CDR1与CDR3残基进行扫描。

图注：HuJovi-1与TRBC2结合的计算模拟突变

模型分析结果显示，Thr28Lys（Mut1）突变体在TRBC2模型中亲和力显著提升（δaff=-13 Ko），而对TRBC1的亲和力则有所下降（δaff=+3 Ko）（下图a、b）。对抗原表位的进一步分析表明，Tyr32突变可降低抗体与TRBC1的结合能力。

图注：HuJovi-1的CDR突变提升TRBC2特异性

Thr28Lys、Tyr32Phe双突变体（Mut2）不仅降低了对TRBC1的亲和力，还提高了对TRBC2的亲和力（上图c、d）。为了通过CDR3内靠近结合口袋的氨基酸替换来接合TRBC2第119位的游离Lys，基于Thr28Lys、Tyr32Phe突变构建了小型靶向文库。

筛选发现，Ala96Asn突变体对TRBC2的结合能力最强，对TRBC1的结合能力最弱。该Thr28Lys/Tyr32Phe/Ala96Asn三突变体（Mut3）被命名为KFN（上图e、f）

以上所用筛选范围相对较窄，为验证该范围外的进一步修饰是否能带来更优结果，研究人员构建了数百个推测可增强TRBC2特异性的蛋白变体（如下图），不过结果未发现任何突变体对TRBC2的结合能力优于KFN。

图注：HuJovi-1衍生克隆的亲和力谱

亲和力ELISA结果显示，KFN和RFN（Arg28/Phe32/Asn96，即Mut4）变体对TRBC2与TRBC1的亲和力差异最大（如下图），KFN对TRBC2的亲和力最强且特异性最高，这进一步验证了所用理性设计策略的有效性。

图注：噬菌体展示文库构建及亲和力ELISA实验

综上，研究人员借助BioLuminate，成功设计出极具潜力的特异性抗体KFN。它实现精准靶向的深层分子机制是什么呢？尽请关注下一篇。

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参考资料

1. Ferrari, Mathieu et al. “Structure-guided engineering of immunotherapies targeting TRBC1 and TRBC2 in T cell malignancies.” Nature communications vol. 15,1 1583. 21 Feb. 2024, doi:10.1038/s41467-024-45854-3

2. https://www.schrodinger.com/life-science/solutions/antibody-design/