MetaCore应用分析案例三：如何使用MetaCore分析MicroRNA网络

点击数：7242012-02-09 16:01:11　来源: 源资科技官网

背景介绍：

    miRNAs是一系列约22个核苷酸长度的非编码RNA分子，能够与靶mRNA互补分子结合，抑制mRNA的翻译。
    尽管miRNAs在线虫中是首次发现的，但是在其他多种物种中已鉴定出数千种miRNAs。目前对于miRNAs在胚胎发育中的机制了解不多，但是在干细胞维持、造血细胞分化和脑发育等众多重要生命现象中miRNAs都起到重要作用。在这些过程中，如果miRNAs表达异常往往会导致癌症发生。因此将多种miRNAs作为重要的癌症靶点也不足为奇。在人类基因组中，有很多经常在癌症中扩增的或者是敲除的基因区域经常发现miRNAs。与正常的组织相比较，在恶性肿瘤中经常发现很多重要的miRNAs的表达是下调的。因此，鉴定疾病状态下的miRNAs分子的表达模式，并找出被它们调节的靶基因在这些疾病中的作用对于疾病发生机制的了解或者分析有着重要的意义。而且与mRNA相比较，miRNA的稳定性更高，能够忍受激烈的实验处理过程。
    在这儿，我们运用MetaCore对人乳腺癌中miRNA分子的表达的变化趋势进行分析，并进一步揭示其中包含的功能过程。

材料和方法：

    在这个研究中所使用的公共实验数据来自于GEO, miRNA表达数据(GSE7842)由Blenkiron等人提交，基因表达数据（GSE4382）由Sorlie等人提交。所选择的miRNA的预测靶点来自于miRBase（http://microrna.sanger.ac.uk.）。
    Blenkiron等人运用磁珠筛选流式细胞技术并结合Luminex芯片检测技术从93个人乳腺癌肿瘤组织中得到309个miRNA表达数据。他们的目标是通过miRNA表达数据对乳腺癌进行分类（Luminal A, Luminal B, Basal-like, HER2+ 和Normal Like）。他们发现miRNA表达的变化绝大多数是由于在转录水平和转录后水平上的调节所致。例如DICER1在Basal-like, HER2+和Luminal B肿瘤中有显著的下调。我们在MetaCore中通过计算每个亚型的miRNAs的平均表达水平来做进一步的分析。
    Sorlie等人分析了乳腺癌的基因表达模式，并根据其亚型进行分类。在这个研究中，我们从Erbb2组以及Basal组中各选取了3个样本，并将实验数据overlay到通过MetaCore建立的预测靶点网络中。
    我们使用MetaCore构建了miRNA的网络，并鉴定了每个亚型的miRNAs表达的变化（Table 1）。同时我们根据每个miRNA已知的靶点和预测的靶点为每个expression trend 构建了expanded network。同时对得到的每个网络的objectlist 进行Enrichment analysis, 分析跟每个trend相关的top functional processes。最后我们将来自于Basal和Her2+的表达数据overlaid 到每个network中，进一步验证miRNA和target之间表达变化关系。

结果：

    根据每个肿瘤亚型构建miRNA网络，我们发现每个亚型的miRNA表达模式类似（Table 1）。例如，随着疾病进展期的增加，106b,25, 210, 19a, 93的表达增加，而130a, let-7e的表达下降，在所有亚型中miRNA都是高表达的有148b, 34a, 在所有亚型中都是低表达的有23a和31。
    通过鉴定出的miRNA的数据的趋势，我们根据每种表达趋势所代表的miRNA以及每个预测靶点的数据构建了网络。例如随着疾病进展表达上升，由miRNA 106b, 25, 210,19a, 93构建的网络（见图1和2），所有已知的靶点（来源于MetaCore的数据库）用蓝色线条连接而预测的靶点（来源于相互作用文件）用粉色线条连接。

  
    为了探索每个趋势所表达的生物功能，我们将每个网络所包含的基因输出到MetaCore中，生成一个gene list的文件，可以用于功能方面的分析。Figure 3为根据GeneGo图谱分类体系进行的功能分析的结果。GeneGo Map Folders是根据各种细胞进程相关的不同图谱进行的分类，比如说细胞G1和G2过度期包含不同的经典pathway图谱，但是都是跟细胞周期调控相关的。有趣的是，随着grade progression 表达上升的miRNA所影响到的Pathway是跟细胞周期调节相关的（cell cycle and its regulation），Luminal A和B型中表达上升的miRNA所影响到的也是同样的Pathway（细胞周期调节相关的）；而随grade progression表达下降的miRNA所影响到的Pathway是跟血管的生成相关（vascular development），而在Basal/Her2+中表达上升的miRNA所影响到的Pathway 同样也是跟血管的生成相关（Figure 3）。 因此通过miRNA预测的作用靶点，进一步的扩大每一个网络，从而得到与每一个亚型特定的网络。比如说，在Figure 3A中，inflammation 和tissue remodelling 是跟随着grade progression而升高的miRNA相关的调节网络，而利尿（Diuresis）是只有在随grade progression而下降的miRNA相关的调节网络。像血管收缩（vasoconstriction），神经信号传导（neurotransmission）以及Ca2+信号转导（Calcium）是只有在Basal和Her2+亚型中才会出现的miRNA调节网络。最后代表Luminal A和B趋势的miRNA调节网络描述的是雄性激素的信号转导（androgen signaling）。

Figure 3: Histograms representing top GeneGo Map Folders from the enrichment analysis of the gene lists associated with the trends identified in Table 1. Key differentially representative processes are represented in rectangles. In each histogram, the longer the length of each bar the more significant (-log pvalue) the folder. The results are organized according to descending significance.

    为了能够将将上面鉴定出的趋势网络图跟已经发表的基因表达数据结合起来，我们尝试将Sorlie等人发表的关于Basal和Her2+乳腺癌样本的基因表达数据添加到我们所构建的miRNA靶点网络上面。我们基于这样一个假设，即miRNA表达上升，相应的调控靶点的表达就会下降，我们就可以将表达下降的靶点作为相应亚型的biomarker, 如Figure 4A所示，p21和MTF是miRNA 106b的靶基因，在Basal亚型中表达下降；而PTEN在Her2+亚型中缺失。Table 2总结了Sorlie等人数据里缺失靶点表达的结果，从这一结果里我们还发现了大多数的Her2+靶点与Let-7e相关而在Basal亚型中靶点表达与miRNA 487, 21, 130a相关。

Figure 4 (A): Auto-expand network of miRNA that increase in expression with grade progression with predicted and known targets (similar to Figure 1A). Expression data from tissue samples of Basal subtype (taken from Sorlie et al.) is overlaid (blue or red filled circlestop right of selected objects). Targets that decrease in expression (targets with blue circles), in accordance with increase miRNA expression are highlighted (open red circles).

Figure 4 (B): Auto-expand network of miRNA that increase in expression with grade progression with predicted and known targets (similar to Figure 1A). Expression data from tissue samples of Her2+ subtype (taken from Sorlie et. al.) is overlaid (blue or red filled circlestop right of selected objects). Targets that decrease in expression (targets with blue circles), in accordance with increase miRNA expression are highlighted (open red circles).

Table 2: Summary of observations obtained by overlaying gene expression data from cancer subtypes on miRNA target networks (identified above). Networks for each miRNA trend (Figure 1) were overlaid with expression data from Sorlie et al. (basal and Her2+). Targets that were found to be lost in expression were noted for each miRNA in each network and tabulated below.

结论：

    Blenkiron等人的研究提供了一个在乳腺癌分类中的基础工具用于miRNA表达分析。在这里，我们扩大了他们的结论，并在他们的表达谱的基础上确定miRNA的群体，网络和通路分析，以方便分类鉴定乳腺癌亚型。通过扩大含已知和预测的miRNA靶基因的miRNA的网络空间，我们还确定了每个趋势所代表的关键过程。此外，扩大了的miRNA网络与表达分析结合在一起可以用来划定每个亚型特定的miRNA靶基因。 MetaCore的相互作用文件的功能分析工具的关键在于： 1）分析miRNA在每个亚型中的表达变化（趋势）， 2）描绘miRNA靶网络， 3）描述每个已知和预测的miRNA网络相关的功能过程。