基于结构的虚拟筛选、分子对接、动力学模拟和体外活性测定的方法发现一些新的利什曼原虫γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂

2018-03-16 14:33:27 来源:源资科技市场部

新闻摘要:谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gcs)是一个重要的锥虫甘肽合成酶。Gcs催化谷氨酸和半胱氨酸生成γ-谷氨酰半胱氨酸、ADP及无机磷。Gcs主要分布于真菌、锥虫、杜氏利什曼虫等体内。杜氏利什曼虫会引起内脏利什曼虫病(或称黑热病),致病性很强﹐患者如不治疗﹐死亡率可达90%以上。因此发现一些新的Gcs抑制剂,用于治疗利什曼虫病非常重要。


背景介绍:
      谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gcs)是一个重要的锥虫甘肽合成酶。Gcs催化谷氨酸和半胱氨酸生成γ-谷氨酰半胱氨酸、ADP及无机磷。Gcs主要分布于真菌、锥虫、杜氏利什曼虫等体内。杜氏利什曼虫会引起内脏利什曼虫病(或称黑热病),致病性很强﹐患者如不治疗﹐死亡率可达90%以上。因此发现一些新的Gcs抑制剂,用于治疗利什曼虫病非常重要。


实验过程:

 

图1 实验过程

  因没有利什曼虫的谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gcs)的晶体结构,所以采用同源模建的方法,选择同源性较高的酿酒酵母的Gcs(PDB_ID: 3LVV)作为模板进行对接研究。

  选择Mabridge 数据库的55000个化合物进行对接筛选。首先使用Suflex-Dock的标准模式进行对接,得到2041个化合物,然后使用超高精度模式Geomx进行对接,得到369个化合物。接着进行可视化分析,得到20个化合物。可视化分析的标准为:1、小分子与活性口袋互补;2、小分子可以和Phe179,Met322,Tyr397或Trp477形成疏水相互作用;3、小分子可以和Glu52,Glu55,Glu92,Glu99,Gln328,Tyr397,Lys483,Arg494或Arg498形成氢键。最后使用三种软件对得到的20个分子进行重新对接,并选择三个软件对接打分都较高的5个化合物进行活性测定。


实验结果:
1.筛选结果
  将筛选得到的5个化合物对接到谷氨酰半胱氨酸合成酶(Gcs)的活性口袋,结果如下表1、图2所示。它们和残基Glu92、Asn324和Arg498之间存在极性相互作用,和残基Phe179、Met322、Tyr397、Trp477之间存在疏水相互作用。值得注意的是,这些相互作用的氨基酸是保守的,同样存在于锥虫、酵母和人的谷氨酰半胱氨酸合成酶中。但是,氨基酸Glu52只存在于锥虫中,在人和酵母中Glu52的位置处为Arg。活性较好的抑制剂应该与这些氨基酸形成较强的相互作用,这些相互作用可以为新抑制剂分子的设计提供思路。

  从图2A可知,所有配体都能和Arg498形成氢键相互作用。BTB13334和BTB13337还与Glu53、Glu92、Glu99、Gln328形成氢键作用。Glu99、Gln328与HTS05833、HTS01124形成氢键相互作用。所有配体的芳香环都与Phe179、Try397、Trp477、Met322形成疏水相互作用。

  这5个化合物的对接模式和已知抑制剂BSO的对接模式相似。图2B为5个化合物的叠合结果,从图中可以看出这5个化合物都有一个极性中心、一个疏水取代基和一个极性取代基。抑制剂BSO也有一个极性中心、一个疏水取代基和一个极性取代基。从叠合结果和对接结果可以得到这5个化合物可能比BSO的抑制活性要好,并且能较好的与活性口袋周围氨基酸形成相互作用。

表1 通过对接筛选得到的5个化合物及其相互作用的氨基酸

 


 

 

图2 (A)筛选得到的5个化合物在蛋白质活性口袋的相互作用图;(B)5个化合物的叠合结果。


2.动力学模拟结果
      使用Amber12软件,对5个化合物与蛋白质的复合物进行10 ns的动力学模拟。从图3A可以看出,蛋白质与配体BTB13334,BTB13337,HTS05833,HTS01124,HTS11169形成的复合物的RMSD值分别稳定在0.69,0.65,0.77,0.64和0.73 nm。复合物的RMSD变化较大可能是因为存在LOOP区的残基。图3B的RMSF值变化表明在波动较大的残基200-300处为蛋白质的LOOP区。从图3C动力学模拟过程中配体的RMSD值变化可以看出,经过10 ns的动力学模拟后5个配体达到稳定构象。从图3D可以看出,5个配体都能与Glu92和Arg498形成氢键相互作用。BTB13334和Glu55之间有较强的氢键作用,BTB13337与Asn324、Arg373之间有较强的氢键作用,HTS11169与Glu55、Gln328、Arg373之间有较强的相互作用。

 

图3 动力学模拟结果。(A)复合物的RMSD值变化;(B)RMSF值变化;(C)配体的RMSD值变化;(D)配体与活性口袋周围氨基酸的氢键占有率。


3.活性测定
      实验测定了5个化合物在浓度100和25 µM时对杜氏利什曼原虫的抑制率。从图4的抑制率结果图可以看出,BTB13337在100 µM时抑制率达到60%,BTB13334、HTS05833、HTS11169在100 µM时的抑制率分别为34、36、20%。化合物BTB1334、HTS05833、HTS11124在25 µM时抑制率大于25%。


图4 5个化合物对利什曼虫的抑制活性


结论:
      已知抑制剂BSO及其衍生物对哺乳动物的谷氨酰半胱氨酸合成酶的抑制活性较好,但缺少特异性,并且抑制剂BSO会对小鼠产生毒副作用。因此发展新的谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂非常重要。本研究使用分子对接、动力学模拟和生物活性测定等方法得到了5个新的谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂。这5个抑制剂对杜氏利什曼原虫的抑制效果较好,并且对人产生的毒副作用较小。新发现的5个抑制剂结构相似,可以和活性口袋的Phe179、Tyr397、Trp477形成疏水相互作用。抑制剂分子与残基Phe179、Tyr397和Trp477之间的疏水相互作用能增强其抑制活性,提高其特异性。新发现的5个抑制剂分子可以作为先导化合物设计出一系列新的谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂。


参考文献:
Pragati  Agnihotri, Arjun K Mishra, Shikha Mishra, Vijay Kumar Sirohi, Amogh A. Sahasrabuddhe, J. Venkatesh Pratap. Identification of Novel Inhibitors of Leishmania donovani γ-Glutamylcysteine Synthetase using Structure Based Virtual Screening, Docking, Molecular Dynamics Simulation and In vitro Studies. J. Chem. Inf. Model. 2017, DOI: 10.1021/acs.jcim.6b00642.

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