IPA应用——纵向转录组分析发现治疗的急性莱姆病患者持续的差异基因表达特征

2017-02-15 17:20:54 来源:源资科技市场部

新闻摘要:莱姆病(Lyme disease)是蜱传播莱姆病螺旋体细菌(Borrelia burgdorferi)引起的疾病,与关节炎、脑膜炎与面部神经麻痹相关,极少数患者因心肌炎猝死。大多数患者接受合适的抗生素治疗后,能够快速康复,无后遗症。而少数病人仍具有持续性症状,伴随传播性疾病,发展为更严重的疾病,延迟抗生素治疗。


背景
      莱姆病(Lyme disease)是蜱传播莱姆病螺旋体细菌(Borrelia burgdorferi)引起的疾病,与关节炎、脑膜炎与面部神经麻痹相关,极少数患者因心肌炎猝死。大多数患者接受合适的抗生素治疗后,能够快速康复,无后遗症。而少数病人仍具有持续性症状,伴随传播性疾病,发展为更严重的疾病,延迟抗生素治疗。
      为了更好地理解人类宿主在急性莱姆病的反应机理和治疗后症状发展中的作用,本文对29位刚确诊的莱姆病患者和13位对照组的周边血液单核细胞(PBMCs)进行转录组研究,治疗后观察6个月。使用IPA软件对转录组数据进行网络和通路分析,探索急性莱姆病和治疗后症状的分子机制,发现可能性治疗标志物。


病人招募,样本收集和转录组分析
     
分别在3个时间点收集29位急性莱姆病患者和13位没有急性疾病的对照组的PBMC样本,进行RNA-Seq与通路分析。3个时间点分别是:V1(诊断急性莱姆病的时间,比开始抗生素治疗的时间早),V2(四环霉素治疗3周,即一个疗程后),V5(治疗完成后6个月)。

 

图1 本文研究原理图
(A)临床预估时间线和PBMCs取样;(B)疾病治愈或有持续症状的患者数量流程图。注:PTLDS,莱姆病治疗后症状。


转录组数据分析结果
1. 莱姆病基因表达特征
      研究初步比较V1的29位莱姆病患者与13位对照的PBMC转录组,发现了1235个差异性表达基因(DEGs)(见图2A与表1),其中大约69%(n=847)DEGs上调,31%(n=388)DEGs下调。在V2的转录组数据分析发现了1060个DEGs,其中63%(n=670)DEGs上调,37%(n=390)DEGs下调。63% DEGs都出现在V1与V2(见图2B)。与对照组相比,在V5的莱姆病转录组没返回基线,仍有686个DEGs,其中54%(n=373)DEGs上调,46%(n=313)DEGs下调。主要成分分析(Principal Component Analysis,PCA)显示每个样本分类(V1、V2、V5与对照组)的部分重叠簇(见图2C)。

表1 DEGs数量,|Fold Change|≥1.5,P值<0.05,FDR<0.1%

 


2. 莱姆病转录组的通路分析
      IPA分析莱姆病DEGs,预测通路结果显示,在V1时,炎症反应、监测免疫细胞与血液系统通路是激活状态,这跟急性感染阶段(如:莱姆病)的预期一致(见图2D与图3)。这些类型的通路在V2与V5时,仍是激活状态,而在V5时,总体的基因表达模式是受到更强烈的抑制(图3)。
      IPA分析转录组数据,预测10个最相关的经典通路结果显示,V1的第8个通路、V2的第10个通路和V5的第4个通路与宿主免疫应答相关(见图2E)。调控翻译开始和延伸的eIF2信号通路在三个时间点都是显著下调,而TREM1通过DAP12、白细胞介素6(IL-6)与IL-12的上调,介导的Th1促炎反应通路只在V1与V2显著上调。另外,与炎症和细胞凋亡相关的多个Toll样受体(TLR1,-2,-4,-7与-8)在V1与V2也是显著上调。
      在V1与V2,莱姆病的大多数上游调控子是促炎细胞因子、标志物(CSF2、γ干扰素[TNF-γ] 与抗促炎细胞因子(IL-6与IL-10))、细胞表面标志物CD40L、转化生长因子β1、信号转导介导因子TICAM、转录调控因子NF-κB和免疫球蛋白复合物(见图2F)。TNF-α是eIF2信号传导、TREM1和TLR通路的主调控子。在V5,10个最相关的上游调控子主要调控基因表达(MYCN、HOX-A7、SAT-B1、HNF-4A、MYC、FOS和ELAVL1)(见图2F)。

 

 

图2 IPA分析莱姆病DEGs结果
(A)莱姆病诊断时(V1)、治疗后3周(V2,抗生素标准治疗周期后)和治疗后6个月(V5),三个时间点的上调基因数量或下调基因数量的柱状图。(B)莱姆病患者和对照组在三个时间点的DEGs数量的文氏图。(C)莱姆病患者和对照组在三个时间点鉴定的1759个独特的DEGs的主成分分析(PCA)图。星号表示对照组的一个DEG看起来在PCA图外,但事实却相反。注意PC轴占数据集变异的8%。(D)10个最相关的疾病和功能。(E)10个最相关的经典通路。(F)10个最相关的上游调控子(不包括药物)。图D-F内容是IPA分析三个时间点的转录组测序数据,进行通路和基因的富集性分析的结果。根据预测的-log(P值)对通路、疾病等进行排序,分别取前10个结果。颜色根据Z值标注,橘色表示激活,蓝色表示抑制,灰色表示活性状态不确定,红色线表示IPA分析设置的显著性阈值(P<0.05)。

 

图3 预测与莱姆病相关的疾病或功能热图

  IPA分析V1、V2与V5转录组数据,分别与数据集最相关的疾病或功能热图。热图颜色根据Z值而定,橘色表示激活,蓝色表示抑制,灰色表示不确定活性状态。


3. 比较急性莱姆病与其他感染疾病
      将急性莱姆病患者在V1的转录组数据与12个以前发表的其他急性病毒(细菌)感染患者或体外感染的细胞培养模型的转录组数据集,进行比较分析。根据分析结果(见图4A与4B)可知,莱姆病螺旋体细菌体外感染人类其他细胞的转录组数据,其中44% DEGs与莱姆病在V1的相同。此外,莱姆病螺旋体细菌体外感染人类内皮细胞的转录组数据29% DEGs与莱姆病在V1的相同、人类神经母细胞瘤细胞的是13%和原代猴胶质细胞的是11%。

 

图4 莱姆病转录组与其他临床疾病或细胞模型的转录组比较
(A)急性莱姆病在V1与其他传染疾病或感染的体外细胞培养模型的转录组数据比较,相同的DEGs与经典通路百分比柱状图。(B)比较急性莱姆病在V1的相关通路与其他细菌或病毒感染的相关通路,部分通路-log(P值)对比柱状图。(C)比较急性莱姆病在V5与三种慢性和(或)自身免疫综合症(SLE、CFS和RA)的转录组数据,相同的DEGs和经典通路百分比柱状图。(D)比较急性莱姆病在V5与三种慢性和(或)自身免疫综合症的相关通路,部分通路-log(P值)对比柱状图。颜色根据Z值而定,橘色表示激活,蓝色表示抑制,灰色表示活性状态不能预测。红色线表示IPA分析设置的显著性阈值(P<0.05)。


结论
1.莱姆病早期的基因表达特征与其他急性感染病不同,感染后至少持续三周。
2.研究发现多个之前未发现的通路和基因,例如: HLA基因(HLA-DQA1、 HLA-DQB1与HLA-DRB5)将来可能是莱姆病诊断的生物标志物,可能是研发新疗法的潜在靶标。
3.IPA软件分析转录组DEG数据的结果是本研究结果或讨论的基础。


原文
Longitudinal Transcriptome Analysis Reveals a Sustained Differential Gene Expression Signature in Patients Treated for Acute Lyme Disease. J Bouquet, MJ Soloski, A Swei, et al. American Society of Microbiology, January/February 2016 Volume 7 Issue 1 e00100-16.

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